具抗肿瘤活性放线菌菌株YIM 90022的分离和系统发育分析

从青海盐碱土壤样品中分离到一株兼性嗜碱放线菌YIM 90022,该菌株的发酵产物具有很强的体外抗胃癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌、肾癌和子宫癌肿瘤细胞株活性。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,菌株YIM90022属于拟诺卡氏属(Nocardiopsis)的成员,与该属的4个有效发表种N.exhalansDSM 44407T,N.prasinaDSM43845T,N.metallicusDSM 44598T和N.listeriDSM 40297T系统发育关系最密切,与其分别以98.8%,98.5%,98.4%和97.8%的16S rRNA基因核苷酸序列相似性聚为一簇。但菌株YIM 90022不与这4个有效种中任何一个单独相聚,形成了一个独立亚分枝。结合形态特征、生理生化特性、细胞化学分类特征,以及rep-PCR基因指纹分析等方面的研究结果,菌株YIM 90022可能为拟诺卡氏菌属的一个潜在新种。菌株YIM 90022在大多数培养基上生长良好,气生菌丝和基内菌丝丰富,在酵母膏麦芽膏琼脂、燕麦片琼脂等培养基中产生可溶性色素。生长pH范围6.0~12.0,最适pH 8.5;能在含0~15%NaCl(W/V)的培养基上生长。     

断奶仔猪源大肠杆菌LEE及HPI毒力岛的检测

应用Duplex_PCR方法,对240株断奶仔猪源大肠杆菌分离株的LEE毒力岛的eaeA基因和耶尔森菌强毒力岛核心区的irp2基因进行了检测,并对HPI毒力岛的fyuA基因及其在大肠杆菌染色体中的插入位置进行了分析,以及随机选取部分PCR产物进行了克隆和序列分析。结果表明:其中29株(12.08%)为LEE HPI ,39株(16.25%)为LEE ,11株(4.58%)为HPI ;另外还发现:不同病例来源的分离株之间,两种毒力岛的携带率不同;在断奶仔猪腹泻源分离株中,29株(20.71%)为LEE HPI ,22株(15.71%)为LEE ,9株(6.43%)为HPI ;断奶仔猪水肿病源分离株中,仅5株(6.58%)为LEE ,2株(2.63%)为HPI ,未发现LEE HPI 菌株;断奶仔猪水肿病并发腹泻源分离株中,仅12株(50%)为LEE ,未发现HPI 及LEE HPI 菌株。本实验克隆的eaeA(425bp)与已发表序列完全一致,irp2(280bp)f、yuA(948bp)、asn_tRNA_intB(1391bp)均与已发表的序列高度同源,同源性分别在98.2%、98.3%、95.8%以上;40株LEE HPI 或HPI 分离株中,29株(72.5%)为fyuA ,且其HPI毒力岛位于大肠杆菌染色体asn_tRNA位点。     

利用反向遗传技术研究H9N2亚型AIV传播途径的分子机制

利用反向遗传技术,通过基因重排方法,产生两个表面基因来自A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)株和其余基因来自A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV株的3株H9N2亚型重排AIV,动物传播性试验发现A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株、A/Chicken/Guangdong/SS/94(H9N2)AIV株和3株H9N2亚型重排AIV都可以经直接接触途径传播;在粪便接触途径下,3株重排AIV都不经粪便接触传播;只有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株和重排AIV RF7/SSHA能经过气溶胶途径传播。HI试验结果进一步证明了以上的结果。实验结果表明H9N2亚型AIV的NA基因与H9N2亚型AIV气溶胶传播途径有重要的关系,即1998年中国大陆H9N2亚型AIV大流行可能是因为病毒获得气溶胶传播途径的特性,推测病毒的NA基因发挥了重要作用。     

盐单胞菌属BYS1四氢嘧啶合成基因ectABC克隆及其盐激表达

利用SEFA-PCR技术从中度嗜盐菌Halomonassp.BYS-1总DNA中克隆了四氢嘧啶合成基因ectABC及其上游序列(GenBank accession number DQ017757);OMIGA软件分析结果显示ectA、ectB、ectC位于同一个操纵子上,大小分别为573bp1、251bp和387bp,预测编码的DAT(L-二氨基丁酸转氨酶)、DAA(L-二氨基丁酸乙酰转移酶)和ES(四氢嘧啶合酶)大小分别为21.1kDa(191 amino acid)、45.7kDa(417 amino acid)和14.5kDa(129 amino acid);将包含ectABC基因及其上游1000bp序列的片段克隆到pUC19中并转化E.coliDH5α,转化子E.coli(pUC19ECT)能够在盐激条件下合成四氢嘧啶,但其耐盐能力没有得到显著改善。     

Sinorhizobium morelens S-5中N-氨甲酰基水解酶基因的克隆、表达和纯化

N-氨甲酰基水解酶是一种非常具有工业应用价值的水解酶,可用于制备光学纯氨基酸。通过LA PCR从Sinorhizobium morelensS-5菌中克隆到1.3kb的DNA片段,测序表明该片段上含有一个完整的N-氨甲酰基水解酶的基因(hyuC)序列。将hyuC基因克隆到表达载体pET30a上,重组质粒pET30a-HyuC在大肠杆菌中获得了高水平表达。重组的N-氨甲酰基水解酶经过热处理和三步柱色谱分离而纯化。纯化倍数为16.1倍,收率21.2%。该酶为同源四聚体,亚基分子量是38kDa。最适温度是60℃,最适pH为7.0。该酶有较高的热稳定性和氧化稳定性。Fe2 和Ca2 对酶的活性有一定的促进作用,而金属螯合剂和巯基试剂对酶活无明显影响。     

中国部分地方鸡种MHC B-G基因第二外显子的遗传多态性

根据鸡主要组织相容性复合体BG基因序列设计特异性引物,在9个中国地方鸡种和1个国外引进鸡种基因组中扩增了包括其第一内含子和第二外显子在内、长度为401bp的DNA片段。经PCRSSCP分型筛选后,对该片段的核苷酸序列进行克隆测序和直接PCR测序及比对分析,发现了31个MHCBG新等位基因;各等位基因主型所含有的亚型数及其在不同品种间的分布极不均衡。第二外显子核苷酸序列和其所编码的MHCBG抗原类IgV结构域氨基酸序列比较表明,在中国地方鸡种BG基因第二外显子的207bp序列中有37个多态性变异位点,其中简约性信息位点29个,单个位点的变异8个;等位基因间的遗传变异范围0.0013-0.1433;各变异位点的核苷酸变异指数0.206-1.462。该编码区核苷酸的异义替换率为9.26%±1.92%,高于同义替换率2.34%±0.90%。所估计的核苷酸转换数和颠换数随着遗传距离的增加而逐渐增加,当核苷酸转换数和颠换数达到平衡后,该片段核苷酸转换数的增加幅度逐渐高于颠换数。在其所编码的类IgV结构域氨基酸序列中,多态变异位点有22个,其中简约性信息位点6个,单变异位点16个;所估测的等电点为8.45,疏水性氨基酸占40.3%,亲水性氨基酸占29.9%;该序列具有明显的疏水性特点。等位基因间的系统发生分析表明,31个BG等位基因分为两个群,相同主型的等位基因首先聚类。本研究为鸡BG基因的免疫功能和遗传进化研究提供了分子依据     

牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定

利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bostaurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determiningregionontheYchromosome)基因编码区全长序列。序列分析表明牛SRY基因的HMG区(Highmobilitygroup)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%。将SRY基因与pET-28a( )载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%。对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的牛SRY蛋白。通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(MullerianInhibitingsubstances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用。     

养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分离鉴定及特征

利用间歇曝气选择性富集并对所获菌株的好氧反硝化活性进行检测。筛选到一株亚硝酸盐去除活性较高的好氧反硝化细菌。在溶解氧（D0）为3.80-5．21mg／L的培养条件下。该菌株10h内将亚硝态氮由26．18mg／L降至0;在盐度为0—25之间20h内均可达到同样的去除效果。通过形态学特征、生理生化反应及部分长度16SrDNA序列分析对筛选菌株进行鉴定,初步判定它为嗜麦芽寡养单胞菌Stertotrophomonas maltophilia。亚硝酸盐还原酶基因分析结果表明。该菌株只含亚硝酸盐还原酶nitS基因,其序列与Alcaligenes faecalis A15（后来被重新鉴定为Pseudomonas stutzeri）的nirS基因序列相似。     

外来种互花米草入侵模式与爆发机制

互花米草（Spartina alterniflora Loisel）因其促淤造陆和消浪护堤作用显著而被许多国家引种,如今却在侵入地快速蔓延并呈现爆发趋势,对生态系统造成了极大危害,被认为是研究生物入侵生态学和遗传学的模式植物。从种群的入侵力、生态系统可入侵性和入侵通道3个方面探讨互花米草的爆发机制,研究结果表明高遗传分化和基因渗入能力是互花米草爆发的遗传基础,对逆境的高抗性和强竞争力是其快速扩张的保障,而高繁殖系数是互花米草爆发的源泉。我国互花米草种群的早期扩散人为影响超过了自然过程,快速扩张呈现出点源扩散和多点爆发的特点,从而为其种群控制带来困难,同时种子的跳跃式和连续式扩散在互花米草种群维持、更新和爆发中有重要作用,强有力的克隆生长能力也为互花米草种群的连续扩张提供了保障。现阶段要完全控制和根除互花米草是不实际的,但在及时预测预警的基础上,应用成本一效益分析方法,采取有序控制和综合开发利用的策略,仍可望妥善解决互花米草入侵所带来的负面效应。     

生物源性基因疫苗的运送系统

基因疫苗具有很多独特的优点,已经成为疫苗研究领域的热点。但由于其免疫原性相对较弱,限制了基因疫苗的广泛应用。人们一直在寻求一种理想的基因疫苗运送系统,它不仅能将基因疫苗导入体内,还能提高基因疫苗的免疫原性,诱导机体产生持续高水平的免疫应答反应。